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Carte VITEK 2 AST-ST01 pour Streptococcus

IntégréTéléchargement
Carte VITEK®2 AST-ST01 pour Streptococcus
pneumoniae, un nom compliqué pour une
solution simple ?
Image 1 : Streptococcus pneumoniae image Opota IMU
Image 2 : image carte AST-ST01 (12)
Flament Quentin & Gambini Maude
ESsanté Lausanne – 55e TAB-ES
Janvier – Mars 2016
Institut universitaire de microbiologie
Mme Maria Senra Ortiz & Dr Guy Prod’hom
Sommaire
Streptococcus pneumoniae est un cocci à Gram positif pouvant induire des pneumonies, des
méningites ou des septicémies. La mise en place d’une antibiothérapie rapide et adaptée est
essentielle pour la survie des patients. Afin d’administrer un traitement adéquat et d’éviter le
développement de résistances, plusieurs antibiotiques sont testés et la sensibilité du germe
déterminée.
Actuellement, le laboratoire de Microbiologie du CHUV utilise la technique de Kirby-Bauer
associée aux E-test comme technique de référence, malgré des difficultés de lecture des
antibiogrammes du à l’hémolyse incomplète qu’induit Streptococcus pneumoniae.
Le but de ce travail est d’évaluer une nouvelle façon de procéder en automatisant et surtout en
standardisant l’interprétation des résultats grâce à la carte AST-ST01 en comparant la méthode
du Kirby-Bauer, la méthode par E-test® et la technique automatisé VITEK®2 de BioMérieux.
L’automatisation permet un rendu des résultats plus rapide (moyenne de 13h) et une plus
grande fiabilité en évitant des erreurs de lecture des antibiogrammes et la retranscription des
résultats dans le système informatique du laboratoire.
La carte AST-ST01 est tout à fait satisfaisante en termes de sensibilité et fiabilité pouvant
remplacer de manière sûre les techniques actuelles.
2
Abstract
Streptococcus pneumoniae is a Gram positive cocci that may cause pneumonia, meningitidis or
septicemia. Antibiotic susceptibility testing (AST) is performed to determine the sensitivity of the
bacteria. Because Streptococcus pneumonia is a clinically important pathogen, the traitement
should be accurate and appropriate for the patient. In order to optimize the therapy and to
predict the outcome of the traitement, an antibiotic susceptibility testing is performed
systematically.
Actually, in the CHUV Diagnostic Laboratory of Microbiology, AST is performed by conventional
manual technics (Kirby-Bauer and E-test®) which generates difficult interpretations, because of
the hemolysis of the pathogen.
The purpose of this work is to evaluate a new approach by automating and especially by
standardizing the interpretation of the results. The AST-ST01 VITEK®2 card has been compared
to conventional disk diffusion (Kirby-Bauer) and minimal inhibitory concentration (MIC) technics.
The use of the AST-card would be an excellent alternative approach in the cas by performing
the test in 13 h and improving the workflow and the management of the results.
The automated AST approach would avoid human-based errors of results report.
The card AST-ST01, compares to the manual technics gives very good results, in terms of
sensitivity, fiability and identification of resistance patherns
3
Table des matières
1.
2.
Introduction ......................................................................................................................... 6
1.1
Streptococcus pneumoniae : Généralités..................................................................... 6
1.2
Les facteurs de virulence connus ................................................................................. 6
1.3
Infections à Streptococcus pneumoniae....................................................................... 7
1.4
Les mécanismes de résistance de Streptococcus pneumoniae ................................... 7
Antibiogramme .................................................................................................................... 9
2.1
Kirby-Bauer .................................................................................................................. 9
2.2
CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) ..................................................................... 9
2.3
VITEK®2......................................................................................................................10
2.4
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) ....................11
3.
But .....................................................................................................................................11
4.
Développement ..................................................................................................................11
5.
4.1
Matériels .....................................................................................................................11
4.2
Méthode......................................................................................................................12
4.2.1
Préparation des souches .....................................................................................12
4.2.2
Préparation des antibiogrammes .........................................................................12
4.2.3
Première lecture ..................................................................................................13
4.2.4
Interprétation des résultats...................................................................................14
4.2.5
Arbre décisionnel CMI et Kirby-Bauer ..................................................................15
4.2.6
Analyse des discordants CMI E-test® ...................................................................17
4.2.7
Analyse des discordants Kirby-Bauer ..................................................................18
Résultats ............................................................................................................................18
5.1
Pénicilline (critères méningés) ....................................................................................19
5.2
Pénicilline (critères non-méningés) .............................................................................20
5.3
Oxacilline ....................................................................................................................21
5.4
Ceftriaxone .................................................................................................................22
5.5
Ampicilline ..................................................................................................................23
5.6
Lévofloxacine ..............................................................................................................25
5.7
Triméthoprime – Sulfaméthoxazol ...............................................................................26
5.8
Vancomycine ..............................................................................................................27
5.9
Erythromycine .............................................................................................................28
5.10
Clindamycine ..............................................................................................................29
4
5.11
Tétracycline ................................................................................................................30
5.12
Temps d’incubation .....................................................................................................31
5.13
Validation de la méthode.............................................................................................31
5.13.1
Souche ATCC 49619 ...........................................................................................31
5.13.2
Validation de la technique ....................................................................................32
5.14
Synthèse des résultats ................................................................................................33
6.
Discussion .........................................................................................................................34
7.
Conclusion .........................................................................................................................36
8.
Conclusion personnelle ......................................................................................................38
9.
Coûts du projet ..................................................................................................................39
10.
Remerciements ..............................................................................................................40
11.
Bibliographie ..................................................................................................................41
12.
Table des illustrations .....................................................................................................43
13.
Table des tableaux .........................................................................................................44
14.
Table des graphiques .....................................................................................................45
15.
Lexique...........................................................................................................................46
16.
Annexes .........................................................................................................................47
5
1. Introduction
1.1 Streptococcus pneumoniae : Généralités
Ce germe a été découvert en 1926 et nommé Diplococcus pneumoniae jusqu’en 1974 avant
d’être classé dans le genre Streptococcus en raison de son arrangement en chaînettes dans un
milieu liquide.
Il s’agit d’un cocci à Gram positif immobile, catalase négative, sensible à l’optochine et
désoxycholate positif (autolyse induite par la bille). Il est aéro-anaérobie facultatif et pousse sur
des milieux riches comme les géloses au sang de mouton, où il présente une hémolyse
incomplète de type α.
On le trouve fréquemment dans la flore commensale des voies aériennes supérieures de
l’homme et peut être également potentiellement pathogène.(1) (2)
Image 3 : Coupe d’un cocci à Gram positif (1)
1.2 Les facteurs de virulence connus
Le principal facteur de virulence du Streptococcus pneumoniae est la capsule. C’est une
enveloppe externe de nature polysaccharidique composée d’un polymère de haute viscosité.
Elle possède plusieurs rôles :
o
o
o
Stocker les réserves énergétiques
Protéger de la phagocytose du système immunitaire (neutrophiles, macrophages)
Protéger la bactérie de la dessiccation
Streptococcus pneumoniae possède également d’autres facteurs de virulence :
o
o
o
o
Protéines de surface : permettent de se fixer aux cellules ciliées des bronches
Pneumolysines : enzymes lysant les cellules respiratoires et endothéliales
Neuraminidase : enzyme provoquant une viscosité du mucus
Hyaluronidase : enzyme permettant à la propagation du germe à travers les tissus (1)
(3)
6
Image 4 : Représentation de Streptococcus pneumoniae (21)
1.3 Infections à Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae fait partie de la flore commensale du rhinopharynx. Il est
responsable de la majorité des cas des pneumonies communautaires ainsi que des méningites
bactériennes.
Il peut causer d’autres pathologies comme des otites moyennes aigües, des sinusites, des
bactériémies, des septicémies, des ostéomyélites, des péricardites, des endocardites, des
péritonites et des arthrites septiques.
Dans les cas de pneumonie à Streptococcus pneumoniae le taux de mortalité varie entre 5 et
10% malgré un traitement antibiotique adapté. (4) (5)
1.4 Les mécanismes de résistance de Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae est naturellement sensible à la plupart des antibiotiques utilisés
pour les bactéries à Gram positif comme les β-lactamines, glycopeptides, macrolides et la
rifampicine. Jusqu’à ce jour, Streptococcus pneumoniae n’est pas connu pour produire une βlactamase. On observe toutefois des résistances occasionnelles aux β-lactamines. Cette
résistance est d’origine chromosomique. Le mécanisme d’action est une altération des
protéines PLP induisant une diminution d’affinité pour les β-lactamines. Ces résistances
proviennent de recombinaisons de séquences résistantes d’autres germes homologues comme
Streptococcus de groupe mitis ou d’autres Streptococcus pneumoniae résistants, mais peuvent
aussi être dues à des mutations naturelles. (6) (7) (8)
7
Image 5 : Principe de résistance de Streptococcus pneumoniae aux β-lactamines (8)
Les β-lactamines sont des antibiotiques couramment utilisés pour traiter les infections à
Streptococcus pneumoniae. L’apparition de résistances à cette famille d’antibiotiques pose un
problème de santé publique majeur. De nouvelle génération d’antibiotique sont actifs sur ces
souches comme :
o
o
o
les synergistines (Pyostacine)
les kétolides (Télithromycine, macrolide de 3ème génération)
les oxazolidinones (Linézolide)
Tous ont une fonction inhibitrice de la synthèse des protéines en agissant au niveau de la sousunité ribosomale 50S.
Et les fluoroquinolones (Lévofloxacine) qui empêchent la réplication de l’ADN bactérien. (6) (9)
8
2. Antibiogramme
2.1
Kirby-Bauer
La méthode de Kirby-Bauer est utilisée pour déterminer la sensibilité in-vitro d’une bactérie aux
antibiotiques. Cette méthode est standardisée et permet, grâce à la mesure d’un diamètre
d’inhibition, d’évaluer la sensibilité à un antibiotique donné :
-
-
2.2
Gélose Mueller-Hinton (épaisseur et composition standardisée). Cette gélose peut être
remplacée par une Mueller-Hinton enrichie au sang de cheval et au NAD (MHF) pour les
bactéries à croissance difficile.
L’ensemencement est standardisé avec une solution saline 0.85 % à McFarland 0.5
correspondant à environ 1.5*108 germes d’Escherichia coli/ml.
Des disques de buvard imprégnés d’un antibiotique spécifique, à une concentration
connue, sont déposés sur la gélose.
L’incubation se fait à une température de 35±2°C en atmosphère normale sauf pour les
bactéries à croissance difficile. (incubation en CO2 4-6%).
CMI (Concentration Minimale Inhibitrice)
La CMI est la concentration minimale inhibitrice. Cela représente la plus petite quantité
d’antibiotique qui inhibe la croissance bactérienne.
Il existe 2 méthodes :
o
En milieu liquide
 Cette méthode consiste à préparer une série de dilutions géométriques de
l’antibiotique choisi. Le premier tube sans croissance bactérienne visible indique
la concentration minimale inhibitrice. (10)
Image 6 : Dilution géométrique pour une CMI (22)
9
o
En bandelette (CMI E-test®)
 Le E-test® ou appelé aussi « Espilometer
essai » permet de déterminer la résistance
aux antibiotiques grâce à la technique du
« gradient exponentiel ». Ce système
permet de quantifier la sensibilité des
germes aux antibiotiques.
La bandelette rectangulaire possède un
gradient prédéfini, continu et exponentiel
des
concentrations
d’antibiotique
immobilisées sur toute sa longueur. Une
zone d’inhibition en forme d’ellipse permet
d’interpréter la concentration à laquelle le
germe est sensible. (11)
2.3
Image 7 : Photo personnelle
VITEK®2
Le VITEK®2 est un appareil de marque déposé par BioMérieux qui permet d’effectuer des
antibiogrammes et des identifications de façon automatique à partir d’une suspension
bactérienne préalablement préparée. La carte VITEK®2 AST-ST01 utilisée pour ce travail de
diplôme permet d’interpréter un antibiogramme grâce à 64 micropuits contenant un gradient
d’antibiotique déshydraté reconstitué lors de la mise en culture par l’automate. Un puits
contenant uniquement du milieu de culture va servir de témoin de croissance. L’appareil incube
et lit la carte toutes les 15 minutes grâce à un photomètre et transfère les données au logiciel
afin de déterminer la sensibilité de la souche. Le VITEK®2 a une connexion bidirectionnelle
avec le LIS (MOLIS). L’automate dispose également d’un système expert qui contient les règles
d’interprétation de l’antibiogramme. (12)
Image 9 : Système VITEK®2 (12)
Image 8 : Système VITEK®2 (12)
10
2.4
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing)
EUCAST est un comité de l’ESCMID (European Society of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases) qui régit les tests de sensibilité antibactériens in vitro et les critères d’interprétation
des antibiogrammes. Cet organisme a pour but d’uniformiser les procédures et les critères
d’interprétation de l’antibiogramme en Europe. Les procédures sont révisées chaque année et
de nouvelles recommandations éditées. (13) (14)
EUCAST différencie les valeurs pour la Pénicilline méningés et non-méningés (infection
respiratoire) (cf. Annexe 3). En raison de la difficulté de traitement pour les méningites, les
intervalles de sensibilité à la Pénicilline sont plus étroits.
3. But
Le but de ce travail de diplôme est l’évaluation de la carte VITEK®2 AST-ST01 pour
Streptococcus pneumoniae comparé à l’antibiogramme manuel selon la méthode de KirbyBauer qui pose des difficultés de lecture dues à l’hémolyse incomplète.
Un collectif de 100 souches a été constitué, selon un panel de résistance variable pour
l’évaluation de cette carte.
4. Développement
4.1
Matériels
o
o
o
o
o
o
Géloses au sang de mouton (5%) « Columbia »
Disque optochine
Anses stériles 10µl
Anses stériles 1µl
100 souches de Strecptoccus pneumoniae
1 souche ATCC 49619 Streptococcus pneumoniae
 Souche contrôle de qualité interne
o
VITEK®2, BioMérieux
 NaCl 0.45%
 Tubes stériles
 Cartes AST-ST01
 Densitomètre (du VITEK®2)
 Anses stériles 1µl
 Géloses au sang de mouton (5%) « Columbia »
 Écouvillons stériles
11
o
4.2
CMI / Kirby-Bauer
 NaCl 0.45%
 Densicheck (Densitomètre du VITEK®2)
 Anses stériles 1µl
 Écouvillons stériles
 Géloses
- Sang de mouton (5%) « Columbia »
- MHF (Mueller-Hinton au sang de cheval, 5%)
 E-tests® / Disques antibiotiques
Méthode
Comparaison des 2 méthodes : carte AST-ST01 vs Kirby-Bauer/CMI sur 100 souches de
Streptococcus pneumoniae.
La souche ATCC 49619 Streptococcus pneumoniae est utilisée comme souche de référence
pour valider le VITEK®2 et la méthode manuelle.
4.2.1
Préparation des souches
Pour chaque souche une subculture a été effectuée sur gélose « Columbia » avec un disque
d’optochine afin de vérifier l’espèce et la pureté.
Un 2ème isolement est effectué sur les souches pures pour effectuer les antibiogrammes.
Les souches non confirmées comme Streptococcus pneumoniae sont remplacées par d’autres
souches de la collection du laboratoire. Les souches contaminées sont ré-isolées et testées une
deuxième fois avec un disque d’optochine.
4.2.2
Préparation des antibiogrammes
VITEK®2 préconise l’utilisation d’une solution NaCl à 0.45% pour la préparation de l’inoculum
bactérien a la place de la solution NaCl à 0.85% communément utilisé pour le test de KirbyBauer.
La densité de l’inoculum est également modifiée avec un McFarland entre 0.6 et 0.7 mesuré
avec le densitomètre du VITEK®2, au lieu du McFarland 0.5 couramment utilisé. Ce procédé a
été introduit et approuvé par le laboratoire de microbiologie du CHUV, en raison de la différence
de concentration en NaCl qui induit une lyse prématurée des bactéries. Par conséquent, le
McFarland a été augmenté.
Une gélose « Columbia » de pureté a été faite pour chaque antibiogramme.
Nous avons testé la souche ATCC 49619 Streptococcus pneumoniae avec les 2 méthodes pour
valider les techniques utilisées dans ce travail.
12
La même suspension bactérienne est utilisée pour :
o
Kirby-Bauer :
 ensemencement de 2 plaques Mueller-Hinton au sang avec l’ajout des
antibiotiques suivants :
Le set n°6 contient la Clindamycine (DA 2µg), l’Erythromycine (E 15µg), le
Bactrim (SXT 25µg).
Le set n°7 contient la Lévofloxacine (LEV 5µg), la Tétracycline (TE 30µg),
l’Oxacilline (OX 1µg) et la Vancomycine (VA 5µg)

o
ensemencement de 3 plaques Mueller-Hinton au sang avec l’ajout de 3 bandes
E-test®. L’Ampicilline (AMP), la Ceftriaxone (CRO), la Pénicilline (P).
VITEK®2 : carte AST-ST01
Antibiotiques testés par la carte AST-ST01
Benzylpéniciline
Résistance inductible à la clindamycine
Pneumonie
Erythromycine
Méningite
Clindamycine
Autre
Linézolide
Ampicilline
Vancomycine
Céfotaxime
Tétracycline
Ceftriaxone
Triméthoprime/sulfaméthoxazole
Lévofloxacine
Tableau 1 : Antibiotiques testés par la carte AST-ST01
Système expert du VITEK®2 :
o
o
o
Benzylpénicilline : il interprète l’antibiogramme en fonction du prélèvement.
Exclusion de tous les antibiogrammes forcés pour correspondre au phénotype du
Streptococcus pneumoniae.
La carte AST-ST01 possède un puits de la résistance inductible à la Clindamycine mais
n’est pas interprété pour cette espèce.
4.2.3 Première lecture
Les lectures des antibiogrammes ont été réalisées par 1 ou 2 expérimentateurs selon les règles
suivantes :
o
o
Résultats « largement sensibles » : lecture effectuée par une seule personne.
Résultats à la limite du seuil de sensibilité, intermédiaires, résistants : lecture effectuée
par 2 personnes.
Chaque gélose a été scanné avec le lecteur KIESTRA BD ImagABT afin de garder une trace
iconographiques des antibiogrammes pour l’analyse de discordances éventuelles.
13
4.2.4
Interprétation des résultats
Chaque résultat a été comparé et classé dans différentes catégories de discordance, les
résultats la méthode de Kirby-Bauer et les CMI par E-test® ont été utilisés comme valeur
de référence.
Les discordances sont classées en 3 groupes :
o
o
o
Discordance mineure
Nous avons considéré comme discordances mineures, les différences liées à la
méthode :
 Valeur proche des seuils critiques (+/- une dilution pour les CMI)
 Interprétations :
 I  R ou R  I
 S  I ou I  S
Discordance majeure
Nous avons considéré comme discordances majeures les interprétations qui sont
«Résistantes» au VITEK®2 alors que la méthode Kirby-Bauer & CMI E-test® donne un
résultat «Sensible».
Discordance «Very major»
Nous avons considéré comme discordances «Very major» les interprétations du
VITEK®2 rendues « Sensibles » alors que la méthode Kirby-Bauer & CMI E-test® donne
un résultat «Résistant». Cette discordance peut induire une inefficacité du traitement en
engendrant un échec thérapeutique.
14
4.2.5
Arbre décisionnel CMI et Kirby-Bauer
Les arbres décisionnels montrent schématiquement la démarche pour l’évaluation des
discordances en fonction des techniques CMI (E-test®) ou Kirby-Bauer.
VITEK/CMI
Concordance
Discordance
OK
Relecture
Autres
discordances
Discordance
mineure
Refaire
Discordance
Very major
OK
Concordance
OK
Majeure
Mineure
Figure 1 : Algorithme CMI E-test®
15
Concordance
OK
VITEK/KirbyBauer
Concordance
OK
Discordance
Discordance
mineure
Refaire
OK
Discordance
Very major
Majeure
Mineure
Figure 2 : Algorithme Kirby-Bauer
16
Concordance
OK
4.2.6
Analyse des discordants CMI E-test®
Tous les cas discordants (mineur, majeur et « Very major ») ont été réinterprétés à l’aide du
programme SHQIViewer (KIESTRA BD ImagABT) qui intègre une option «X-Ray» facilitant la
relecture des CMI E-test®. Une grande partie des erreurs de lecture ont pu être corrigées.
o
L’option X-Ray analyse 2 paramètres pour chacun des pixels : le contraste local et le
rapport signal sur bruit (SNR). Pour qu’un point (pixel) soit visible en X-Ray, il faut non
seulement qu’il soit contrasté mais aussi y avoir une «confiance» élevée (rapport signal
sur bruit).
La représentation est faite en couleur et cette opération est effectuée sur chacun des
canaux Rouge, Vert, Bleu de l’image SHQI. Les informations provenant de chacun des
canaux sont fusionnés pour obtenir une image représentant une sorte de «radiographie»
de la plaque.
Image 10 : Principe du X-Ray, fourni par Dr Antony Croxatto
17
4.2.7
Analyse des discordants Kirby-Bauer
Pour l’interprétation des discordants majeurs et «Very major» observées entre le VITEK®2 et la
méthode Kirby-Bauer. Les 2 tests ont été répétés.
La comparaison a été faite entre le VITEK®2 et l’antibiotique discordant. Le CMI E-test® de
l’antibiotique répété est ajouté comme «gold standard».
5. Résultats
VITEK®2
Les résultats seront présentés sous cette forme :
I
Concordant
Discordance
mineure
Discordance
mineure
R
Discordance
mineure
Concordant
Discordance
majeure
S
Discordance
mineure
Discordance
Very major
Concordant
I
R
S
CMI E-test® / Kirby-Bauer
Tableau 2 : Présentation des résultats
18
5.1 Pénicilline (critères méningés)
Résultats initiaux CMI E-test® – VITEK®2
Concordant
VITEK®2
I
R
S
71
I
R
CMI E-test®
Mineur
Discordant Majeur
Very major
2
27
S
98%
0%
2%
0%
Tableau 3 : Pénicilline méningé, répartition initiale (%)
Tableau 4 : Pénicilline méningé, répartition initiale
Analyse des discordances CMI E-test® – VITEK®2
Méthode
Souche
F2
B7
CMI
®
VITEK 2
Valeur [µg/ml]
S/I/R
0.12
R
0.25
R
E-test
Valeur [µg/ml]
0.06
0.03
®
S/I/R
S
S
relecture CMI
E-test®
Valeur [µg/ml]
S/I/R
0.12
R
0.25
R
Tableau 5 : Pénicilline méningé, tableau des discordances
VITEK®2
Résultats après relecture des CMI E-test® – VITEK®2
I
R
S
Concordant
73
I
R
CMI E-test®
27
S
Mineur
Discordant Majeur
Very major
100%
0%
0%
0%
Tableau 6 : Pénicilline méningé, répartition après investigation (%)
Tableau 7 : Pénicilline méningé, répartition après investigation
19
5.2 Pénicilline (critères non-méningés)
VITEK®2
Résultats initiaux CMI E-test® – VITEK®2
I
R
S
60
3
2
Concordant
27
S
Mineur
Discordant Majeur
Very major
7
I
R
CMI E-test
95%
5%
0%
0%
Tableau 8 : Pénicilline non-méningé, répartition initiale (%)
®
Tableau 9 : Pénicilline non-méningé, répartition initiale
Analyse des discordances CMI E-test® – VITEK®2
CMI
Méthode
Souche
2-D4
2-C4
2-A9
F2
B7
®
VITEK 2
S/I/R
4
R
4
R
4
R
0.12
I
0.25
I
Valeur [µg/ml]
E-test
Valeur [µg/ml]
2
2
2
0.06
0.03
®
S/I/R
I
I
I
S
S
relecture CMI
E-test®
Valeur [µg/ml]
S/I/R
2
I
2
I
2
I
0.12
I
0.25
I
Tableau 10 : Pénicilline non-méningé, tableau des discordances
VITEK®2
Résultats après relecture des CMI E-test – VITEK®2
I
R
S
Concordant
62
3
7
I
R
CMI E-test®
27
S
Mineur
Discordant Majeur
Very major
97%
3%
0%
0%
Tableau 11 : Pénicilline non-méningé, répartition après investigation (%)
Tableau 12 : Pénicilline non-méningé, répartition après investigation
20
5.3
Oxacilline
K-B OX
Comparaison Kirby-Bauer Oxacilline – CMI Pénicilline non-méningé
I
R
S
62
4
I
7
R
27
S
®
CMI E-test Pénicilline non-méningé
Tableau 13 : Comparaison Oxacilline vs Pénicilline non-méningé
Lorsqu’un échantillon est positif à Streptococcus pneumoniae, un disque d’Oxacilline est
systématiquement testé pour déterminer la sensibilité ou la résistance aux β-lactamines. En cas
de sensibilité [≥20mm], les CMI ne sont pas faites et le résultat est considéré définitivement
comme sensible.
Il a été mis en évidence que sur toutes les souches Oxacilline sensible, 4 souches (13%)
présentaient une résistance partielle à la Pénicilline, confirmé par CMI E-test® et pour la carte
AST-ST01.
Analyse des discordances Kirby-Bauer Ox-CMI Péni non-méningé-VITEK®2 Péni non-méningé
Méthode
Souche
2-E5
2-E4
I8
I2
CMI Pénicilline non-méningés
VITEK®2
E-test®
Valeur [µg/ml]
Valeur [µg/ml]
S/I/R
S/I/R
0.25
I
0.25
I
0.12
I
0.12
I
0.12
I
0.12
I
0.12
I
0.25
I
Kirby-Bauer
Oxacilline
Valeur [mm]
S/I/R
21
S
24
S
24
S
22
S
Tableau 14 : Discordance Oxacilline vs Pénicilline non-méningé / VITEK®2
L’observation des résultats démontre que la carte AST-ST01 permet d’éviter des erreurs dans
la prise en charge de l’antibiothérapie du patient par le médecin.
La carte AST-ST01 montre une très bonne corrélation avec la mesure manuelle des E-test®.
21
5.4
Ceftriaxone
VITEK®2
Résultats initiaux CMI E-test® – VITEK®2
I
R
S
21
1
1
I
8
Concordant
65
S
Mineur
Discordant Majeur
Very major
4
R
CMI E-test
90%
10%
0%
0%
Tableau 16 : Ceftriaxone, répartition initiale (%)
®
Tableau 15 : Ceftriaxone, répartition initiale
Analyse des discordances CMI E-test® – VITEK®2
Méthode
Souche
2-C7
2-B6
I9
F6
C3
B6
A9
B4
2-C4
G5
CMI
VITEK®2
Valeur [µg/ml]
S/I/R
2
I
2
I
1
I
1
I
1
I
1
I
1
I
1
I
4
R
0.5
S
E-test®
Valeur [µg/ml]
0.5
0.5
0.5
0.5
0.25
0.5
0.5
0.25
1
1
S/I/R
S
S
S
S
S
S
S
S
I
I
relecture CMI
E-test®
Valeur [µg/ml]
S/I/R
1
I
1
I
1
I
1
I
0.5
S
1
I
1
I
1
I
2
R
1
I
Tableau 17 : Ceftriaxone, tableau des discordances
VITEK®2
Résultats après relecture des CMI E-test® – VITEK®2
I
R
S
28
1
Concordant
65
S
Mineur
Discordant Majeur
Very major
5
1
I
R
®
98%
2%
0%
0%
Tableau 18 : Ceftriaxone, répartition après investigation (%)
CMI E-test
Tableau 19 : Ceftriaxone, répartition après investigation
22
5.5
Ampicilline
VITEK®2
Résultats initiaux CMI E-test® – VITEK®2
I
R
S
7
17
1
I
10
R
2
1
54
S
Concordant
Mineur
Discordant Majeur
Very major
CMI E-Test®
77%
22%
1%
0%
Tableau 20 : Ampicilline, répartition initiale (%)
Tableau 21 : Ampicilline, répartition initiale
Analyse des discordances CMI E-test® – VITEK®2
Méthode
Souche
2-E2
2-E1
2-D9
2-D8
2-D6
2-D5
2-D4
B4
2-C8
2-C7
2-C6
2-C4
2-B9
2-B5
2-B3
2-B2
2-A2
F6
F4
2-C9
C8
CMI
®
VITEK 2
Valeur [µg/ml]
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
1
1
<=0.25
4
E-test
S/I/R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
I
I
S
R
Valeur [µg/ml]
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
0.5
0.5
1
0.5
Tableau 22 : Ampicilline, tableau des discordances
23
®
S/I/R
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
S
S
I
S
relecture CMI
E-test®
Valeur [µg/ml]
S/I/R
4
R
4
R
4
R
2
I
4
R
4
R
4
R
4
R
4
R
4
R
2
I
2
I
4
R
4
R
4
R
2
I
4
R
1
I
1
I
2
I
2
I
VITEK®2
Résultats après relecture des CMI E-test® – VITEK®2
I
R
S
9
5
1
I
Concordant
23
R
CMI E-Test®
54
S
Discordant
Mineur
Majeur
Very major
93%
7%
0%
0%
Tableau 23 : Ampicilline, répartition après investigation (%)
Tableau 24 : Ampicilline, répartition après investigation
24
Lévofloxacine
Résultats initiaux Kirby-Bauer – VITEK®2
VITEK®2
5.6
Concordant
I
R
S
1
I
R
99
S
Kirby-Bauer
Discordant
Mineur
Majeur
Very major
100%
0%
0%
0%
Tableau 25 : Lévofloxacine, répartition initiale (%)
Tableau 26 : Lévofloxacine, répartition initiale
25
Triméthoprime – Sulfaméthoxazol
5.7
VITEK®2
Résultats initiaux Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
2
2
2
I
2
42
1
R
2
2
45
S
Concordant
89%
8%
2%
1%
Mineur
Discordant Majeur
Very major
Tableau 27 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition initiale (%)
Kirby-Bauer
Tableau 28 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition initiale
Analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
Méthode
1ère lecture
®
VITEK 2
Souche
Valeur
[µg/ml]
2-E2
2-C6
2-C7
80
160
20
Réanalyse
Kirby-Bauer
S/I/R
Valeur
[mm]
R
R
S
21
18
14
®
VITEK 2
S/I/R
Valeur
[µg/ml]
S
S
R
80
160
20
Kirby-Bauer
S/I/R
Valeur
[mm]
R
R
S
24
25
20
CMI
S/I/R
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
S
S
S
0.19
0.19
0.38
S
S
S
Tableau 29 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, tableau des discordances
VITEK®2
Résultats après analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
2
2
2
I
2
42
R
Kirby-Bauer
2
2
46
S
Concordant
Mineur
Discordant Majeur
Very major
90%
8%
2%
0%
Tableau 30 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition après investigation (%)
Tableau 31 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition après investigation
26
Vancomycine
Résultats initiaux Kirby-Bauer – VITEK®2
VITEK®2
5.8
I
R
S
Concordant
I
R
100
S
Kirby-Bauer
Tableau 33 : Vancomycine, répartition initiale
Mineur
Discordant Majeur
Very major
100%
0%
0%
0%
Tableau 32 : Vancomycine, répartition initiale (%)
27
5.9
Erythromycine
VITEK®2
Résultats initiaux Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
Concordant
I
61
2
R
98%
0%
0%
2%
Mineur
Discordant Majeur
Very major
37
S
Tableau 34 : Erythromycine, répartition initiale (%)
Kirby-Bauer
Tableau 35 : Erythromycine, répartition initiale
Analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
Méthode
Souche
E1
D6
1ère lecture
®
VITEK 2
Valeur
[µg/ml]
Kirby-Bauer
S/I/R
<=0.12
<=0.12
Réanalyse
S
S
Valeur
[mm]
S/I/R
14 R
17 R
®
VITEK 2
Valeur
[µg/ml]
<=0.12
<=0.12
Kirby-Bauer
S/I/R
Valeur
[mm]
S
S
15
15
CMI
S/I/R
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
R
R
2
>256
R
R
Tableau 36 : Erythromycine, tableau des discordances
o
Les deux souches résistantes au Kirby-Bauer présentaient des microcolonies
hétérorésistantes ce qui induit le VITEK®2 en erreur.
VITEK®2
Résultats après analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
Concordant
I
61
2
R
37
S
Kirby-Bauer
Mineur
Discordant Majeur
Very major
98%
0%
0%
2%
Tableau 37 : Erythromycine, répartition après investigation
Tableau 38 : Erythromycine, répartition après investigation
28
5.10 Clindamycine
VITEK®2
Résultats initiaux Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
Concordant
I
53
1
R
1
45
S
98%
0%
1%
1%
Mineur
Discordant Majeur
Very major
Kirby-Bauer
Tableau 39 : Clindamycine, répartition initiale (%)
Tableau 40 : Clindamycine, répartition initiale
Analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
Méthode
Souche
E1
2-B1
1ère lecture
®
VITEK 2
Kirby-Bauer
®
VITEK 2
Réanalyse
Kirby-Bauer
CMI
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
Valeur
[mm]
S/I/R
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
Valeur
[mm]
S/I/R
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
<=0.25
>=1
S
R
15
24
R
S
<=0.25
>=1
S
R
15
24
R
S
1
0.06
R
S
Tableau 41 : Clindamycine, tableau des discordances
o
o
L’échantillon E1 résistant au Kirby-Bauer présentait des microcolonies hétérorésistantes
ce qui induit le VITEK®2 en erreur.
L’échantillon 2-B1 est rendu résistant au VITEK®2 en raison d’un CCE observé sur la
plaque au sang avec la méthode Kirby-Bauer. La présence d’un CCE chez
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae et le genre Staphylococcus traduit
une résistance inductible à la Clindamycine. Cette résistance n’est pas encore validée
pour Streptococcus pneumoniae.
VITEK®2
Résultats après analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
Concordant
I
53
1
R
1
45
S
Mineur
Discordant Majeur
Very major
98%
0%
1%
1%
Kirby-Bauer
Tableau 42 : Clindamycine, répartition après investigation (%)
Tableau 43 : Clindamycine, répartition après investigation
29
5.11 Tétracycline
VITEK®2
Résultats initiaux Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
Concordant
1
I
58
1
R
1
39
S
97%
1%
1%
1%
Mineur
Discordant Majeur
Very major
Tableau 44 : Tétracycline, répartition initiale (%)
Kirby-Bauer
Tableau 45 : Tétracycline, répartition initiale
Analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
Méthode
1ère lecture
VITEK®2
Kirby-Bauer
®
VITEK 2
Réanalyse
Kirby-Bauer
CMI
Souche
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
Valeur
[mm]
S/I/R
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
Valeur
[mm]
S/I/R
Valeur
[µg/ml]
S/I/R
2-D9
E7
4
<=0.25
R
S
27
21
S
R
4
<=0.25
R
S
24
30
I
S
2
0.12
I
S
Tableau 46 : Tétracycline, tableau des discordances
VITEK®2
Résultats après analyse des discordances Kirby-Bauer – VITEK®2
I
R
S
Concordant
2
58
I
R
40
S
Kirby-Bauer
Mineur
Discordant Majeur
Very major
98%
2%
0%
0%
Tableau 47 : Tétracycline, répartition après investigation(%)
Tableau 48 : Tétracycline, répartition après investigation
30
5.12 Temps d’incubation
Les antibiogrammes effectués sur le VITEK®2 ont un temps d’incubation se situant entre 7h45
et 20h30 avec une médiane de 13.4 heures (13h30)
Temps incubation S. pneumoniae
Nombres de souches
8
7
6
5
4
3
2
1
19.75
18.5
17.5
17
16.5
16
15.5
15
14.5
14
13.25
12.75
12.25
11.75
11.25
10.75
10.25
9.75
9.25
8.5
7.75
0
Heures
Graphique 1 : Temps d’incubation pour Streptococcus pneumoniae
5.13 Validation de la méthode
5.13.1 Souche ATCC 49619
P
CRO
AMP
DA
E
SXT
LEV
TE
OX
VA
Valeur EUCAST 0.25-1 0.03-0.125 0.06-0.25 22-28 26-32 20-26 21-27 28-34 8-14 17-23
28
32
26
26
34
10
21
Valeur Kirby [mm]
Valeur CMI [µg/ml]
0.25
0.06
0.06
Tableau 49 : Résultats pour la validation de la méthode
En référence au tableau ci-dessus, les résultats de la souche ATCC 49619 nous permet de
valider la méthode manuelle. En parallèle, la souche ATCC 49619 a validé la carte AST-ST01
automatiquement par le logiciel du VITEK®2. (14) (cf. Annexe 2)
31
5.13.2 Validation de la technique
Afin d’exclure des discordances liées à la procédure (NaCl 0.45% vs 0.85%), les
antibiogrammes des souches présentant une discordance majeure et «Very major» ont été
refaits.
o
o
o
Suspension dans 1ml de bouillon TODD à McFarland 3.5
100µl sont ajoutés à 2 solutions de NaCl :
 1 ml NaCl 0.45% (solution préconisée pour le VITEK®2)
 1 ml NaCl 0.85% (solution préconisée par EUCAST)
Contrôle du McFarland 0.6-0.7 grâce au Densichek
Le Kirby-Bauer est effectué parallèlement sur les deux concentrations de NaCl.
Méthode
Souche
2-E2
2-C6
Triméthoprime/Sulfaméthoxazole
Kirby-Bauer NaCl 0.45%
S/I/R
S
S
Valeur [mm]
28
22
Kirby-Bauer NaCl 0.85%
S/I/R
S
S
Valeur [mm]
27
22
Tableau 50 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Triméthoprime/Sulfaméthoxazole
Méthode
Souche
E1
D6
Erythromycine
Kirby-Bauer NaCl 0.45%
S/I/R
R
R
Valeur [mm]
16
17
Kirby-Bauer NaCl 0.85%
S/I/R
R
R
Valeur [mm]
16
17
Tableau 51 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Erythromycine
Ces 2 souches présentent des microcolonies hétérorésistantes.
Méthode
Souche
E1
2-B1
Clindamycine
Kirby-Bauer NaCl 0.45%
S/I/R
Valeur [mm]
15
28
R
S
Kirby-Bauer NaCl 0.85%
S/I/R
Valeur [mm]
15
28
R
S
Tableau 52 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Clindamycine
La souche E1 présente des microcolonies hétérorésistantes.
32
Méthode
Souche
2-E5
2-E4
I8
Kirby-Bauer Oxacilline vs CMI E-test® Pénicilline
Kirby-Bauer NaCl 0.45%
S/I/R
Valeur [mm]
21
23
22
®
CMI P E-test NaCl 0.45%
Valeur [µg/ml]
0.12
0.06
0.12
S
S
S
S/I/R
I
S
I
Kirby-Bauer NaCl 0.85%
S/I/R
Valeur [mm]
21
23
22
®
CMI P E-test NaCl 0.85%
Valeur [µg/ml]
0.12
0.06
0.12
S
S
S
S/I/R
I
S
I
Tableau 53 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Oxacilline/CMI P
Il n’y a pas d’influence entre l’utilisation de la solution de NaCl à 0.45% et la solution de NaCl à
0.85%. Le résultat des antibiotiques reste identique et les microcolonies sont toujours
présentes.
5.14 Synthèse des résultats
Pour 100 souches après l’analyse des discordances.
Interprétations
Antibiotiques
Pénicilline (méningé)
Pénicilline (nonméningé)
Ceftriaxone
Ampicilline
Lévofloxaxine
Triméthoprime/
Sulfaméthoxazole
Vancomycine
Erythromycine
Clindamycine
Tétracycline
Total
Total %
Discordance
Nbr.
Souche
100
S
I
R
Concordance
27
0
73
100
99
27
62
7
96
3
100
92
100
65
54
99
28
9
0
5
23
1
98
86
100
2
6
100
46
2
42
90
8
100
100
100
100
991
-
100
0
0
37
0
61
45
0
53
40
0
58
540
101
323
56.0% 10.5% 33.5%
Tableau 54 : Résultats pour la synthèse
33
100
98
98
98
964
97.3%
Mineure
2
21
2.1%
Majeure
Very major
2
1
2
1
3
0.3%
3
0.3%
6. Discussion
La carte VITEK®2 AST-ST01 donne des résultats satisfaisants :
1. Résultats :
o
o
o
o
97.3% des essais réalisés sont concordants
2.1% de Discordance mineure
0.3% de Discordance majeure
0.3% de Discordance Very major
L’analyse des résultats a révélé que les discordances majeures et «Very major» représentent à
seulement 0.6%. Ces discordances sont observées avec des antibiotiques rarement
administrés
en
cas
d’infection
à
Streptococcus
pneumoniae
(Triméthoprime/
Sulfaméthoxazole, Clindamycine, Erythromycine).
La présence des discordances majeures et «Very major», nous a poussé à évaluer la
procédure utilisée dans ce travail. Nous avons démontré que l’utilisation de la solution de NaCl
0.45% au lieu du NaCl 0.85% préconisée par EUCAST n’a pas d’influence sur les valeurs
rendues.
2. Croissance
Aucune des souches de Streptococcus pneumoniae de la collection a posé de problèmes de
croissance avec la carte AST-ST01. Environ 90% des souches ont eu une croissance inférieure
à 17h sur le VITEK®2 (valeur médiane de 13h30), ce qui devrait permettre l’utilisation de cette
carte AST sans modification du flux de travail dans le laboratoire.
3. VITEK®2
Lors de cette étude, les antibiogrammes qui ont été «forcés» par le système du VITEK®2
(exemple : I  R) ont été exclus de la comparaison. Les interprétations des antibiogrammes
changés par le logiciel indiquent en commentaire que l’antibiogramme a été contraint pour
correspondre au phénotype sans que l’on puisse le modifier.
La Cefotaxime et le Linézolide présents dans la carte AST-ST01 n’ont pas été comparés en
raison de l’absence de ces disques dans les sets du Kirby-Bauer.
La Pénicilline sur la carte VITEK®2 AST-ST01 donne de meilleurs résultats que le disque
d’Oxacilline utilisé en screening pour les prélèvements respiratoires (13% de discordants).
34
4. Kirby-Bauer
I.
II.
Difficultés de lecture
Durant ce travail, plusieurs discordances ont pu être corrigées après la relecture des
plaques par X-ray (27 cas discordants sur 38 soit 71%, ont pu être réglé grâce au X-ray)
et nous avons constaté plusieurs paramètres qui rendaient la lecture difficile et induire
des discordances. Voici les paramètres observés fréquemment :
o
L’hémolyse incomplète : caractéristique du Streptococcus pneumoniae, elle peut
induire des erreurs de lecture qui seront éliminées avec la carte AST-ST01.
o
Double zone de croissance : certaines souches présentaient une double zone de
croissance qui est difficilement distinguable à l’œil nu.
Atouts du Kirby-Bauer
o Microcolonies : certaines souches présentent des hétérorésistances qui sont
visibles sur une plaque au sang (MHF) mais détectées par le VITEK®2. Ces
microcolonies sont en trop petite quantité pour provoquer un trouble mesurable
par l’automate et démontre la limite de la méthode.
o
CCE : Le VITEK®2 force la résistance à la Clindamycine en présence d’un CCE
alors que ce mécanisme de résistance n’est pas encore reconnu par EUCAST.
5. Limite de l’étude
Dans le collectif des antibiotiques analysé pour la Vancomycine et la Lévofloxacine, une seule
souche était résistante. Au vue de la rareté de ce phénotype, il serait préférable de tester par
CMI les souches données résistantes par la carte AST-ST01.
La sélection de 100 souches de Streptococcus pneumoniae de résistances variées pour
l’évaluation de la méthode de la carte VITEK®2 AST-ST01 est suffisante pour pouvoir introduire
cette méthode en routine.
35
7. Conclusion
i.
Résultats
Les résultats des comparaisons entre les 3 méthodes sont acceptables :
o
o
o
o
97.3% de Concordance
2.1% de Discordance mineure
0.3% de Discordance majeure
0.3% de Discordance «Very major»
Avantages de la carte AST-ST01 :
o
o
o
o
o
o
Gain de temps dans le rendu des résultats
Erreur de lecture supprimée
Pas d’erreur de transcription grâce à la transmission automatique
Stock d’antibiotiques diminué : achat d’une carte uniquement
Sensibilité de l’Oxacilline corrigée par la CMI de la Pénicilline sur la carte AST-ST01
Standardisation dans la lecture et le rendu des résultats
Inconvénients de la carte AST-ST01 :
o
o
Interprétation Clindamycine, CCE ?
Limite de la méthode (microcolonies)
ii.
Prix de la méthode
Nous avons comparé le prix d’un antibiogramme effectué par méthode manuelle (Kirby-Bauer)
et par méthode automatisée (VITEK®2) pour un prélèvement respiratoire qui représente le plus
petit coût.
Nous avons prix en compte plusieurs critères
o
o
o
Manipulation identique Kirby-Bauer vs VITEK®2
 Préparation McFarland 0.5
 Ensemencement de la plaque de pureté
Manipulation spécifique au Kirby-Bauer
 Ensemencement de 2 plaques MHF
 Ajout des disques
 Lecture des diamètres
 Introduction des valeurs de l’antibiogramme dans le système informatique
Manipulation spécifique au VITEK®2
 Scan de la plaque et de la carte
 Vérification des résultats dans le système informatique
36
Kirby-Bauer (Prélèvements respiratoires)
Ensemencement de 2 plaques MHF
Ajout des disques
Lecture des diamètres
Introduction des valeurs de l’antibiogramme dans le système
informatique
2 plaques MHF
set 6 et set 7
Total
unité
Prix/unité
Total
fr. 1.20
fr. 6.00
2
2
fr. 0.86
fr. 0.75
fr. 1.72
fr. 1.50
fr. 9.22
unité
30sec
1min
1
Prix/unité
Total
fr. 1.20
fr. 1.80
fr. 10.79
fr. 10.79
fr. 12.59
2min
3min
Tableau 55 : Matériel Kirby-Bauer
VITEK®2
Scannage de la plaque et de la carte
Vérification des résultats dans le système informatique
Carte VITEK®2 AST-ST01
Total
Tableau 56 : Matériel VITEK®2
Sachant qu’un TAB coûte 70frs/heure, nous avons estimé le coût pour chaque analyse afin de
déterminer le « pour » ou le « contre » de l’introduction de la carte VITEK®2 AST-ST01 en
routine.
La méthode manuelle du Kirby-Bauer coûte environ 3.30frs de moins que la méthode
automatisée VITEK®2. Cependant il faut prendre en compte les erreurs de lecture dues à
l’hémolyse, les erreurs de transcription et le temps cumulé non pris en compte dans le calcul
(exemple : changement des disques d’antibiotique).
En conclusion, malgré le coût supplémentaire qu’engendre l’utilisation de la carte VITEK®2
AST-ST01 le gain de temps et la qualité des résultats rendus sont 2 paramètres essentiels et
nous encouragent à recommander la carte VITEK®2 AST-ST01 pour l’antibiogramme de
Streptococcus pneumoniae.
Nous recommandons l’utilisation de cette carte avec quelques précautions expliquées dans le
tableau ci-dessous :
Antibiotiques
Tetracycline, Clindamycine*, Erythromycine, Bactrim
(SXT)
Vancomycine, Levofloxacine
β-lactamine
Méropenème
Décision
®
Accepter le résultat VITEK 2 tel quel.
Si résistance à confirmer par CMI
En cas de résultats I ou R faire les CMI sur les βlactamines**
Actuellement la carte AST-ST01 ne dispose pas du
Méropenème. La CMI devrait être faite dans les
prélèvements normalement stériles.
Tableau 57 : Arbre décisionnel
*Même si EUCAST n’a pas validé le CCE pour Streptococcus pneumoniae, le principe de précaution voudrait qu’en présence d’un
CCE+, la Clindamycine soit rendue résistante.
**Sur les 12 cas discordants, 11 fois le VITEK®2 donne une résistance plus importante que les CMI. Au vue de la fréquence de
Streptococcus pneumoniae intermédiaire ou résistant aux β-lactamines (23/143 en 2014, cf. Annexe 1) il est préférable de tester
systématiquement les souches avec une sensibilité réduite aux β-lactamines.
37
8. Conclusion personnelle
Ce travail de diplôme en binôme nous a permis de mettre au point une nouvelle méthode. Il
nous a également appris à travailler en équipe malgré certains traits de caractère divergent et
trouver au sein de ce binôme des capacités complémentaires. De plus, ce travail nous a permis
de nous familiariser avec la comparaison de méthodes et les automates du laboratoire.
L’analyse des résultats nous a aidés à développer notre esprit critique tout en améliorant nos
connaissances en informatique.
Nous avons eu beaucoup de plaisir dans la collaboration et la réalisation de ce projet en
espérant avoir fourni un travail de qualité qui sera utile au sein du laboratoire.
38
9. Coûts du projet
La somme pour la réalisation de ce travail de diplôme s’élève à 3423.27.-
Anse 1uL
Anse 10uL
aiguille
écouvillon stérile
tube NaCl VITEK 0.45%
Tube vide
plaque COL
disque OPTO
plaque MHF
CMI P
CMI CRO
CMI AMP
ST01
SET 6 (disque)
SET 7 (disque)
CMI SXT
CMI E
CMI DA
CMI TE
Total
Quantité
244
131
110
110
110
110
389
214
624
101
101
101
101
108
103
3
3
2
2
Tableau 58 : Coûts
39
Prix/unité
0.06
0.05
0.03
0.12
0.46
0.13
0.56
0.32
0.86
3.99
3.99
3.99
10.79
0.75
0.75
4.26
3.99
3.99
3.99
Total
fr.
14.64
fr.
6.55
fr.
3.30
fr.
13.20
fr.
50.60
fr.
14.30
fr. 217.84
fr.
68.48
fr. 536.64
fr. 402.99
fr. 402.99
fr. 402.99
fr. 1'089.79
fr.
81.00
fr.
77.25
fr.
12.78
fr.
11.97
fr.
7.98
fr.
7.98
fr. 3'423.27
10.
Remerciements
Nous tenons à remercier particulièrement :
o
o
Madame Maria Senra Ortiz
Dr Guy Prod’hom
Nous les remercions pour leur soutien dans les moments plus difficiles, leur patience, leurs
conseils et leur investissement dans notre travail.
Nous remercions également toute l’équipe du laboratoire pour leur accueil, leur aide et leur
sympathie. Grâce à eux, nous avons approfondi nos connaissances et développé notre esprit
critique.
40
11.
Bibliographie
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41
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[En ligne] 2008. [Citation : 17 Février 2016.]
http://www.memoireonline.com/04/11/4448/m_Contribution--letude-de-la-cinetique-de-liberationdun-principe-actif-oxacilline-sodique-e21.html.
42
12.
Table des illustrations
Image 1 : Streptococcus pneumoniae image Opota IMU ........................................................... 1
Image 2 : image carte AST-ST01 (12) ........................................................................................ 1
Image 3 : Coupe d’un cocci à Gram positif (1) ........................................................................... 6
Image 4 : Représentation de Streptococcus pneumoniae (21) ................................................... 7
Image 5 : Principe de résistance de Streptococcus pneumoniae aux β-lactamines (8) .............. 8
Image 6 : Dilution géométrique pour une CMI (22) ..................................................................... 9
Image 7 : Photo personnelle .....................................................................................................10
Image 8 : Système VITEK®2 (12) ..............................................................................................10
Image 9 : Système VITEK®2 (12) ..............................................................................................10
Image 10 : Principe du X-Ray, fournie par Dr Antony Croxatto ..................................................17
Figure 1 : Algorithme CMI E-test® .............................................................................................15
Figure 2 : Algorithme Kirby-Bauer .............................................................................................16
43
13.
Table des tableaux
Tableau 1 : Antibiotiques testés par la carte AST-ST01 ............................................................13
Tableau 2 : Présentation des résultats ......................................................................................18
Tableau 3 : Pénicilline méningé, répartition initiale (%) .............................................................19
Tableau 4 : Pénicilline méningé, répartition initiale ....................................................................19
Tableau 5 : Pénicilline méningé, tableau des discordances ......................................................19
Tableau 6 : Pénicilline méningé, répartition après investigation (%) ..........................................19
Tableau 7 : Pénicilline méningé, répartition après investigation ................................................19
Tableau 8 : Pénicilline non-méningé, répartition initiale (%) ......................................................20
Tableau 9 : Pénicilline non-méningé, répartition initiale .............................................................20
Tableau 10 : Pénicilline non-méningé, tableau des discordances..............................................20
Tableau 11 : Pénicilline non-méningé, répartition après investigation (%) .................................20
Tableau 12 : Pénicilline non-méningé, répartition après investigation .......................................20
Tableau 13 : Comparaison Oxacilline vs Pénicilline non-méningé .............................................21
Tableau 14 : Discordance Oxacilline vs Pénicilline non-méningé / VITEK®2 .............................21
Tableau 15 : Ceftriaxone, répartition initiale ..............................................................................22
Tableau 16 : Ceftriaxone, répartition initiale (%) ........................................................................22
Tableau 17 : Ceftriaxone, tableau des discordances .................................................................22
Tableau 18 : Ceftriaxone, répartition après investigation (%) ....................................................22
Tableau 19 : Ceftriaxone, répartition après investigation ...........................................................22
Tableau 20 : Ampicilline, répartition initiale (%) .........................................................................23
Tableau 21 : Ampicilline, répartition initiale ...............................................................................23
Tableau 22 : Ampicilline, tableau des discordances ..................................................................23
Tableau 23 : Ampicilline, répartition après investigation (%)......................................................24
Tableau 24 : Ampicilline, répartition après investigation ...........................................................24
Tableau 25 : Lévofloxacine, répartition initiale (%) ....................................................................25
Tableau 26 : Lévofloxacine, répartition initiale ...........................................................................25
Tableau 27 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition initiale (%) ........................................26
Tableau 28 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition initiale ..............................................26
Tableau 29 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, tableau des discordances .................................26
Tableau 30 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition après investigation (%) ....................26
Tableau 31 : Triméthoprime-Sulfaméthoxazol, répartition après investigation ...........................26
Tableau 32 : Vancomycine, répartition initiale (%) .....................................................................27
Tableau 33 : Vancomycine, répartition initiale ...........................................................................27
Tableau 34 : Erythromycine, répartition initiale (%) ...................................................................28
Tableau 35 : Erythromycine, répartition initiale ..........................................................................28
Tableau 36 : Erythromycine, tableau des discordances ............................................................28
Tableau 37 : Erythromycine, répartition après investigation ......................................................28
Tableau 38 : Erythromycine, répartition après investigation ......................................................28
Tableau 39 : Clindamycine, répartition initiale (%) .....................................................................29
Tableau 40 : Clindamycine, répartition initiale ...........................................................................29
Tableau 41 : Clindamycine, tableau des discordances ..............................................................29
Tableau 42 : Clindamycine, répartition après investigation (%) .................................................29
Tableau 43 : Clindamycine, répartition après investigation ........................................................29
44
Tableau 44 : Tétracycline, répartition initiale (%) .......................................................................30
Tableau 45 : Tétracycline, répartition initiale .............................................................................30
Tableau 46 : Tétracycline, tableau des discordances ................................................................30
Tableau 47 : Tétracycline, répartition après investigation(%) ....................................................30
Tableau 48 : Tétracycline, répartition après investigation ..........................................................30
Tableau 49 : Résultats pour la validation de la méthode ...........................................................31
Tableau 50 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Triméthoprime/Sulfaméthoxazole .................32
Tableau 51 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Erythromycine ..............................................32
Tableau 52 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Clindamycine ...............................................32
Tableau 53 : Comparaison méthode Kirby-Bauer Oxacilline/CMI P...........................................33
Tableau 54 : Résultats pour la synthèse ...................................................................................33
Tableau 55 : Matériel Kirby-Bauer .............................................................................................37
Tableau 56 : Matériel VITEK®2..................................................................................................37
Tableau 57 : Arbre décisionnel ..................................................................................................37
Tableau 58 : Coûts....................................................................................................................39
14.
Table des graphiques
Graphique 1 : Temps d’incubation pour Streptococcus pneumoniae .........................................31
45
15.
Lexique
o
Catalase : Enzyme qui permet la dismutation du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau
(H2O) et dioxygène (CO2). (15)
o
Optochine : Sel de cuivre, l'éthyl-hydrocupréine (16)
o
Désoxycholate : Plus connu sous le nom de lyse par la bile, l’acide désoxycholique
dégrade la capsule de Streptococcus pneumoniae et permet de l’identifier.
o
Phagocytose : Propriété que possèdent certains protozoaires et certaines cellules
(phagocytes) de capturer et ingérer des corps figurés (particules ou micro-organismes).
(17)
o
Dessiccation : Procédé d'élimination de l'eau d'un corps à un stade poussé. Il s'agit
d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut
être naturel ou forcé. (18)
o
Hémolyse alpha : Hémolyse =Destruction des globules rouges. Alpha = hémolyse
partielle, présence d’un halo verdâtre autour des colonies. (19)
o
PLP : Protéine de liaison à la pénicilline
o
Β-lactamine : Large classe d’antibiotiques qui contiennent un noyau β-lactame dans
leur structure moléculaire. (20)
o
MOLIS : Programme informatique utilisé par le CHUV pour le traitement des
échantillons.
46
16.
Annexes
Annexe 1 : Tableau des sensibilités 2014
47
Annexe 2 : Validation de la souche ATCC 49619
48
Annexe 3 : Critères d’interprétation EUCAST pour Streptococcus pneumoniae page 1
Annexe 3 : Critères d’interprétation EUCAST pour Streptococcus pneumoniae page 2
49
Annexe 3 : Critères d’interprétation EUCAST pour Streptococcus pneumoniae page 3
Annexe 3 : Critères d’interprétation EUCAST pour Streptococcus pneumoniae page 4
50
Annexe 3 : Critères d’interprétation EUCAST pour Streptococcus pneumoniae page 5
51
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