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01 Hématopoïèse.indd - John Libbey Eurotext

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Hématopoïèse
01
Hématopoïèse
Hématologie, n� spécial 2, vol. 13, mars 2007
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Hématopoïèse
01-01
Étude de RockI dans les étapes terminales
de la différenciation érythroblastique
G Courtois* 1 ; J Vanderkerkove 2 ; J Kersual 2 ; M Dussiot 2 ;
Z Belaid 2 ; S Coulon 3 ; JA Ribeil 3 ; N Debili 41 ; O Hermine 2
CNRS Umr 8147, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris ;
2
Umr8147, Hôpital Necker, Paris ; 3 Umr8147, Hopital
Necker, Paris ; 4 Inserm U790, Igr, Villejuif
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1
Introduction
La différenciation érythroïde terminale est caractérisée par
des changements morphologiques séquentiels comprenant une
réduction progressive de la taille de la cellule accompagnée
d’une condensation du noyau et de la chromatine faisant intervenir les caspases. Ces évènements sont suivis de l’énucléation
qui résulte de remaniements importants de la membrane plasmique et du cytosquelette. Le rôle des GTPases de la famille Rho
dans ces événements a été peu étudié. Des travaux récents ont
montré que les protéines Rac1 et Rac2 modulent la morphologie
du squelette de l’érythrocyte en maintenant sa flexibilité. Nous
avons étudié la fonction de Rock, la kinase de Rho dans les
étapes terminales de la différenciation. Le rôle de cette kinase
dans la contraction de la membrane plasmique qui s’effectue
lors de l’apoptose a été démontré dans plusieurs systèmes, mais
son rôle dans la différenciation érythroïde reste inconnu
01-02
P210BCR-ABL induit la reprogrammation des
progéniteurs mégacaryocytaires vers la lignée
érythrocytaire par la répression de l’expression
de FLI-1
D Buet* 1 ; H Raslova 1 ; G Juban 2 ; P Jarrier (1) ; JF Geay 1 ;
V Lazar 3 ; A Turhan 4 ; F Morlé 2 ; W Vainchenker 1 ; F Louache 1
Inserm U790, Inserm U790- Institut Gustave Roussy, Villejuif ;
CNRS Umr 5534, Cgmc CNRS Umr 5534, Villeurbanne ;
3
Unité de Génomique Fonctionnelle, Institut Gustave Roussy,
Villejuif ; 4 Upres Ea3805-Université Jean Bernard, CHU de
Poitiers, Poitiers
1
2
Introduction
Les lignées mégacaryocytaire et érythrocytaire se différencient
à partir d’un progéniteur bipotent commun. L’engagement de
ce progéniteur vers l’une ou l’autre de ces voies de différenciation est contrôlé par l’activité de facteurs de transcription et de
voies de signalisation cellulaire. Dans ce travail, nous avons
émis l’hypothèse que l’activité tyrosine kinase de l’oncogène
p210BCR-ABL pouvait modifier la programmation des lignées
érythro-mégacaryocytaires. Plusieurs travaux ont conforté cette
hypothèse en décrivant des reprogrammations de cellules hématopoïétiques en présence de p210BCR-ABL vers la différenciation érythrocytaire.
Matériels et méthodes
Nous avons utilisé un système de différenciation in vitro en
milieu liquide de cellules CD34+ isolées à partir de sang de
cordon en présence d’un cocktail de cytokines et d’un inhibiteur
chimique de Rock (Y-27632) ajouté à différents temps de la
maturation. Pour obtenir une maturation complète allant jusqu’à
l’énucléation, un système de co-culture sur cellules stromales a
été utilisé.
Matériels et méthodes
Dans des conditions de culture permettant la différenciation
mégacaryocytaire ou érythrocytaire, les progéniteurs primaires
humains CD34+ et les cellules de la lignée mégacaryoblastique Mo7e sont transduits à l’aide d’un rétrovirus codant pour
p210BCR-ABL. Des analyses phénotypiques des cellules transduites ont ensuite été réalisées par cytométrie de flux, puces à
oligonucléotides et RT-PCR en temps réel.
Résultats
Nous avons montré que l’inhibiteur de Rock diminue légèrement
la prolifération des érythroblastes et augmente de façon importante leur apoptose. La coloration à la benzidine et les analyses
morphologiques indiquent que l’inhibiteur accélère légèrement
la maturation. Elles montrent également la présence de cellules
dysmorphiques qui conservent une grande taille jusqu’en fin de
culture ou sont multinucléées. Les co-cultures sur stroma montrent
que l’inhibiteur de Rock n’empêche pas l’énucléation
Résultats
L’expression ectopique de p210BCR-ABL dans les cellules
CD34+ induit une différenciation érythrocytaire majeure, au
détriment de la différenciation mégacaryocytaire. Des expériences à l’échelle unicellulaire sur des cellules CD41+CD42(enrichissement en progéniteurs mégacaryocytaires) combinées
à l’utilisation d’un inhibiteur de l’activité tyrosine kinase de
p210BCR-ABL, ont montré qu’une partie des progéniteurs mégacaryocytaires étaient reprogrammés par p210BCR-ABL vers
la lignée érythrocytaire. De manière similaire, l’activité tyrosine
kinase de p210BCR-ABL induit la différenciation érythrocytaire
des cellules Mo7e. Nous avons pu associer l’expression de
p210BCR-ABL à la diminution du niveau d’expression du facteur de transcription FLI-1 grâce à l’analyse des puces. FLI-1 est
impliqué dans la régulation de la différenciation mégacaryocytaire. Son expression est faible durant la différenciation érythrocytaire. Sa ré-expression dans les cellules Mo7e-p210BCR-ABL
qui avaient acquis un phénotype érythrocytaire permet de retrouver leur phénotype mégacaryocytaire. D’autre part, l’inhibition partielle de l’expression de FLI-1 par des shRNA dans des
progéniteurs CD41+CD42- bloque la différenciation mégacaryocytaire de ces cellules et augmente la différenciation vers la
lignée érythrocytaire.
Conclusion
Nous avons montré que Rock est impliqué principalement dans
la cytokinèse de l’érythroblaste comme cela a été démontré
dans d’autres systèmes, et a une fonction en partie redondante
dans la différenciation et la maturation. Ces résultats soulignent
une fois de plus les proximités entre apoptose et différenciation
des érythroblastes.
6
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Hématopoïèse
Conclusion
Ces résultats suggèrent que des cellules engagées dans la voie
de différenciation mégacaryocytaire peuvent être reprogrammées vers la lignée érythrocytaire par l’expression ectopique
de p210BCR-ABL. Ce travail montre également que le facteur
de transcription mégacaryocytaire FLI-1 joue un rôle clé dans la
régulation de l’engagement des cellules vers la voie érythrocytaire ou la voie mégacaryocytaire.
01-03
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Identification et caractérisation de progéniteurs
lin-/SP/ALDHhi et lin-/SP/ALDHmid humains
par une double technique SP/ALDH
O Pierre-Louis 1 ; D Clay 1 ; B Guerton 1 ; JJ Lataillade 2 ;
MC Le Bousse-Kerdilès 1
Inserm U602, Hôpital Paul Brousse - Inserm U602, Villejuif ;
Cts des Armées, Hôpital d’Instruction des Armées Percy,
Clamart
1
2
Introduction
La combinaison de marqueurs phénotypiques, moléculaires et
fonctionnels est nécessaire à la caractérisation et l’isolement
des cellules souches/progéniteurs primitifs. Les marqueurs fonctionnels « SP » et « ALDH », tous deux « spécifiquement » exprimés dans ces cellules ont été récemment utilisés. Les cellules SP
(Side Population) sont caractérisées en cytométrie de flux par
leur capacité à exclure le Hœchst 33342 grâce aux pompes
membranaires. La technique ALDEFLUOR® exploite la fonctionnalité de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH). Dans le but de
rechercher si les cellules exprimant la double fonctionnalité SP/
ALDH présentent des caractéristiques de primitivité différente,
nous avons mis au point une technique de cytométrie de flux
pour identifier et trier des cellules souches/progéniteurs co-exprimant (ou non) les marqueurs SP et ALDH.
Matériels et méthodes
La fraction Lin- (lignage négative) des cellules mononucléées de
moelle osseuse est purifiée sur colonne d’affinité. Les cellules
sont ensuite incubées pendant 1h30 avec du Hoechst 33342
puis les pompes membranaires sont bloquées et le substrat AldefluorTM est ajouté pendant 30 minutes. Les sous-populations
SP/ALDH sont immunophénotypées et leur capacité de prolifération/différenciation est analysée in vitro et in vivo.
Résultats
Nos résultats montrent que les sous populations SP+ALDHHi et
SP+ALDHMid expriment des marqueurs de différenciation hématopoïétique (CD45, CD34, CD38 et Thy1), mésenchymateuse
(CD73, CD271) et endothéliale (KDR, Tie-2). Bien que l’efficacité de clonage soit plus élevée dans la population SP+ALDHHi,
le rapport erythro-granuleux est supérieur dans les cellules
SP+ALDHmid. De plus, la sous-population SP+ALDHHi prolifère à
plus long terme en milieu liquide que la population SP+ALDHmid
et est capable de greffer in vivo chez la souris NOD/SCID, suggérant qu’elles sont plus primitives. Des résultats préliminaires
montrent, de façon surprenante, que la proportion de cellules
Lin-CD34+CD38- est supérieure dans les sous-populations SP–
par rapport aux SP+. Le niveau de primitivité fonctionnelle des
cellules SP+ et SP– dans les sous-populations ALDHHi et ALDHmid
est à l’étude.
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Conclusion
Nos résultats suggèrent que la combinaison de marqueurs de
fonctionnalité SP/ALDH permet l’identification de sous-populations enrichies en progéniteurs hématopoïétiques, endothéliaux
et mésenchymateux de degrés de primitivité différent, en particulier au niveau hématopoïétique.
01-04
Rôle de l’angiotensine II dans l’hématopoïèse
S Badaoui 1 ; O Wagner-Ballon 1 ; D Pisani 1 ; C Monnot 2 ;
A Michaud 2 ; JP Le Couédic 1 ; N Debili 1 ; W Vainchenker 1
U790 INSERM, Institut Gustave Roussy, Villejuif ; 2 U36 Inserm,
Collège de France, INSERM U36, Paris
1
Introduction
Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine I
(IEC) peuvent moduler le niveau plasmatique de plusieurs régulateurs de l’hématopoïèse que sont l’angiotensine II (ATII) et
le peptide AcSDKP. L’utilisation d’IEC dans un modèle murin
d’irradiation induit une radioprotection due à l’inhibition de la
synthèse d’ATII. Connu pour être un régulateur de la tension
artérielle, ATII est impliquée dans l’hématopoïèse.
Matériels et méthodes
Le rôle d’ATII dans la prolifération, la différenciation, la maturation érythrocytaire et l’apoptose est étudié à partir de cellules
humaines CD34+ cultivées en milieu liquide complémenté de
sérum de veau fœtal, de SCF, d’Il-3, d’EPO, en présence ou
non d’ATII (100 nM) ou de Telmisartan (20 ou 200 nM), un
antagoniste du récepteur AT1 spécifique d’ATII.
Résultats
ATII n’a pas d’effet significatif sur la prolifération cellulaire et
la maturation érythroïde. L’ajout de Telmisartan toutes les 24h
induit un retard significatif de différenciation dose-dépendant
avec une diminution de l’expression de la Glycophorine A
(GPA) sur les cellules CD36+. À forte concentration de Telmisartan, la différenciation érythrocytaire est bloquée dès l’acquisition du marqueur CD36+, ce qui se traduit par la persistance
en culture de cellules GPA- CD36- associée à une augmentation
de l’apoptose cellulaire des cellules engagées vers la différenciation (GPA+ CD36+). À J7, sous Telmisartan, les cellules
CD36+ possèdent un potentiel clonogénique diminué par rapport aux cellules issues de cultures non traitées. En revanche, les
cellules CD36- GPA- possèdent un potentiel clonogénique plus
élevé. Le retard de différenciation observé pourrait être associé
au maintien d’un stade primitif des cellules CD34+. Ces expériences suggèrent qu’un blocage d’AT1 inhibe très fortement la
différenciation. L’étude en cytométrie en flux de l’expression de
l’EC montre qu’elle est exprimée à bas niveau sur les cellules
érythroblastiques, mais que son expression augmente nettement
en cours de maturation suggérant que les érythroblastes pourraient produire de l’ATII.
Par ailleurs, nos résultats préliminaires montrent que l’inhibition
d’AT1 diminue la phosphorylation de STAT5 induite par l’EPO.
Conclusion
ATII jouerait donc un rôle important dans la différenciation
érythrocytaire en étant synergique de l’EPO.
7
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Hématopoïèse
01-05
Maintien des progéniteurs hématopoïétiques
par les cellules stromales dérivées des tissus
adipeux humains
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E Ravet 1 ; P Huchette 1 ; J Corre 2 ; B Cousin 1 ; PH Bourin 3 ;
L Casteilla 1 ; P Laharrague 2
1
Université Paul Sabatier, Umr CNRS 5018, Toulouse ;
2
Laboratoire Central d’Hématologie, CHU Rangueil, Toulouse ;
3
Laboratoire de Thérapie Cellulaire, Etablissement Français du
Sang Pyrénées-Méditerranée -, Toulouse
Introduction
Les cellules stromales adhérentes au plastique dérivées des tissus adipeux traités par collagénase (ADCs) présentent de nombreuses analogies avec les cellules mésenchymateuses de la
moelle (MSCs) : phénotype, différenciation en plusieurs lignages conjonctifs, immunotolérance, sécrétion de cytokines et facteurs de croissance. Nous avions montré que les ADCs humaines permettent la différenciation complète des cellules CD34+
dans les lignées myéloïdes et lymphoïdes. Ici nous mettons en
évidence que les ADCs maintiennent les progéniteurs hématopoïétiques en culture, ce qui ouvre des perspectives nouvelles
en thérapeutique.
Matériels et méthodes
Les ADCs isolées à partir de dépôts graisseux sous-cutanés ont
été utilisées en cultures à long terme (LTC) avec des CD34 humaines. La lignée stromale murine MS5 a servi de référence.
L’évolution de la population CD34 a été suivie par cytométrie
en flux. La présence de progéniteurs de type LTC-IC a été recherchée en méthyl-cellulose et leur fréquence évaluée en dilution limite. Grâce à des puces microfluidiques, l’expression de gènes
impliqués dans l’hématopoïèse a été recherchée simultanément
dans des ADCs et de MSCs humaines.
Résultats
En culture à long terme, les cellules hématopoïétiques prolifèrent beaucoup plus rapidement sur ADCs que sur MS5, jusqu’à
J21. À J35, à l’inverse, la prolifération est plus importante sur
MS5. En parallèle, les CD34 diminuent beaucoup plus rapidement sur ADCs. Le nombre de CFC générées après 2 semaines
sur ADCs est supérieur à celui obtenu avec MS5, mais leur
fréquence est inférieure d’environ 1/3. Des colonies de type
GM et BFU-E sont obtenues après 35 jours de culture sans adjonction de cytokines. La fréquence de LTC-IC avec ADCs est
de 1/95, comparable à ce qui est obtenu avec des MSCs. Par
rapport aux MSCs, les ADCs sur-expriment des gènes potentiellement impliqués dans l’interaction CD34/stroma : MCP1,
SDF1, MIP-1α, neuropiline1, ostéopontine, G-CSF, M-CSF, GMCSF, IL-11, IL-6, IL-8, OSM, LIF, TGFb.
Conclusion
En plus de permettre la différenciation complète des progéniteurs
hématopoïétiques, les cellules stromales dérivées des tissus adipeux humains assurent leur maintien à long terme. Les mécanismes en jeu impliquent probablement des contacts cellule-cellule
et la sécrétion de facteurs paracrines. Compte tenu de l’abondance et de la facilité d’accès des tissus adipeux, ces données
permettent d’envisager la co-injection de ces cellules stromales et
de CD34 pour réduire la période d’aplasie post greffe.
Référence
Corre J et al. J Cell Physiol 2006 ; 208 : 282-8.
8
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01-06
Epissages alternatifs spécifiques des cellules
sanguines détectés par puce à ADN « whole exon »
S Tondeur 1 ; C Pangault 2 ; V Pantesco 3 ; JF Schved 4 ; B Klein 5 ;
T Fest 6 ; J de Vos 3
Laboratoire D’Hématologie, institut de Recherche en
Biothérapie, INSERM U847, CHU Saint Eloi, Montpellier;
2
Département Hitc - Upres Ea 3889, CHU Pontchaillou,
Rennes; 3 Institut de Recherche en Biothérapie, INSERM U847,
CHU Saint Eloi, Montpellier; 4 Laboratoire D’Hématologie,
CHU Saint Eloi, Montpellier; 5 Unité de Thérapie Cellulaire,
institut de Recherche en Biothérapie, INSERM U847, CHU
Saint Eloi, Montpellier; 6 Laboratoire D’Hématologie &
Immunologie, upres-Ea 3889, CHU Pontchaillou, Rennes
1
Introduction
Les puces à ADN Exon ST 1.0 (Affymetrix) permettent de mesurer l’expression de l’ensemble de nos exons, connus ou prédits,
soit plus de 1 million d’exons différents. Les cellules sanguines
partagent (i) une même origine cellulaire, (ii) la propriété de circuler librement dans les vaisseaux sanguins et (iii) pour les leucocytes, la propriété de passer du sang aux tissus (diapédèse).
Nous avons entrepris d’analyser le transcriptome de ces cellules
au niveau de l’exon dans le but d’identifier de nouveaux gènes
et des évènements d’épissage spécifiques. L’épissage alternatif
de molécules d’adhésion ou de signalisation pourrait contribuer
aux propriétés biologiques des cellules sanguines.
Matériels et méthodes
Le sang périphérique de 4 sujets témoins a été prélevé. À partir
de 2 µg d’ARN total déglobinisé, le transcriptome du sang total
a été analysé et comparé à une collection de 33 transcriptomes
de 11 tissus humains. Les données ont été normalisées avec l’algorithme RMA, les gènes différentiellement exprimés identifiés
par t-test corrigé par FDR, et les évènements de splicing identifiés en utilisant les logiciels ArrayAssist® (Stratagene) et R.
Résultats
Nous avons détecté 31 185 probesets surexprimés dans le
sang comparativement aux 11 autres tissus (p-value < 0.01,
ratio > 3), qui correspondent à 1916 gènes différents. Cette
liste comporte de très nombreux gènes connus des cellules
érythroïdes tel que l’aminolevulinate delta synthase 2 (ALAS2),
neutrophiles tels que le neutrophil cytosolic factor 1 (NCF1), le
lyzozyme, ou lymphoïdes tels que les CD3, CD7, CCR7, SYK,
etc. La présence de ces gènes valide ces résultats d’expression.
En outre, de nombreux gènes dont l’expression n’avait pas encore été rapportée dans les cellules sanguines sont présents.
Nous avons développé des techniques de recherche d’épissage
(« splicing discovery ») et avons appliqué cette méthodologie à
nos données. Nous avons identifié des profils suggérant des
« exons cassettes », des gènes avec des promoteurs multiples
ou encore avec de multiples sites de poly adénylation. Certains
concernent des gènes codant pour des molécules d’adhésion
ou de signalisation. Nous avons détecté par exemple un épissage alternatif des derniers exons de l’inositol polyphosphate4-phosphatase, type II (INPP4B) et avons validé ce résultat par
RT-PCR.
Hématologie, n� spécial 2, vol. 13, mars 2007
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Hématopoïèse
Conclusion
Ce travail fournit une cartographie de l’expression génique du
sang avec une résolution encore jamais atteinte aujourd’hui.
Il servira de référence pour toutes les analyses ultérieures qui
s’intéresseront au transcriptome des sous-populations leucocytaires du sang et pour le projet Goelams visant à identifier les
modifications transcriptionnelles et protéomiques du sang chez
les patients atteints de lymphome malin à grandes cellules.
Discussion
Ces observations suggèrent que les adipocytes contrôlent la
granulopoïèse par l’intermédiaire d’une inhibition de la production du G-CSF par un mécanisme dépendant d’un contact
direct avec les cellules hématopoïétiques.
Conclusion
L’analyse des mécanismes moléculaires d’inhibition de la production de G-CSF dépendant du contact cellulaire est en cours.
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Rôle des adipocytes médullaires dans la régulation
de l’hématopoïèse
Z Belaid-Choucair 1 ; Y Lepelletier 2 ; A Thiry 3 ; C Humblet 4 ;
M Maachi 5 ; G Poncin 1 ; V Asnafi 6 ; A Gothot 7 ; J Boniver 8 ;
B Nusgens 9 ; O Hermine 10 ; MP Defresne 1
Service Histologie-Cytologie, CHU - Sart Tilman, Liège,
BELGIQUE; 2 Service d’Hématologie et d’Immunologie, CNRS
Umr 8147, Paris; 3 Anatomo-Pathologie, CHU - Sart Tilman,
Liège, BELGIQUE; 4 Service d’Histologie-Cytologie, CHU - Sart
Tilman, Liège, BELGIQUE; 5 Service d’Endocrinologie, Hôpiltal
Tenon, Paris; 6 Hematologie, Hôpital Necker - Departement
d’Hematologie, Paris; 7 Laboratoire d’Hématobiologie et
Immunobiologie, CHU - Sart Tilman, Liège, BELGIQUE;
8
Servive Anatomo-Pathologie, CHU - Sart Tilman, Liège,
BELGIQUE; 9 Lctb, Université de Liège, Liège, BELGIQUE;
10
Service d’Hématologie-Immunologie, CNRS Umr 8147, Paris
1
Introduction
La moelle osseuse est un tissu très complexe dont l’activité hématopoïétique résulte d’interactions entre les cellules stromales
du microenvironnement et les cellules hématopoïétiques. Ces
interactions font intervenir, notamment, des facteurs de croissance (SCF, VEGF, FGF etc..) et des cytokines (GM-CSF, M-CSF,
G-CSF etc..). Parmi les cellules stromales, les adipocytes ont été
pendant très longtemps considérés comme étant des cellules
de remplissage de la cavité hématopoïétique. In vitro, les adipocytes médullaires adoptent une morphologie fibroblastique
(fibroblast-like fat cells : FLFC) mais présentent la majorité des
marqueurs représentatifs d’un adipocyte mature tels que aP2,
PPARγ2, LPL et leptine.
Matériels et méthodes
Pour analyser leur rôle nous les avons co-cultivés avec des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ de moelle en contact direct
ou en absence de contact en utilisant des transwell. Aucune
cytokine exogène n’a été ajoutée aux cultures.
Résultats
Les FLFC expriment et produisent de manière constitutive du
SCF et du M-CSF et induisent la différenciation des CD34+ en
macrophages indépendamment de la condition de culture. En
transwell, les CD34+ se différencient en polynucléaires neutrophiles et du G-CSF est produit dans les milieux de culture. Par
contre en contact direct, la granulopoïèse est absente et il n y a
pas de production de G-CSF. L’apport de G-CSF exogène dans
ces conditions permet de restaurer la granulopoïèse. L’influence
des adipocytes sur les progéniteurs CD34+ a été confirmée in
vivo en co-injectant des FLFC et des CD34+ sous la capsule rénale de souris NOD/SCID : dans ces conditions on observe une
différenciation macrophagique mais pas de granulopoïèse.
Hématologie, n� spécial 2, vol. 13, mars 2007
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01-08
Les mégacaryocytes utilisent un nouveau
mécanisme de polyploidisation : la rétro-cytocinèse
Y Chang 1 ; L Lordier 2 ; F Auradé 2 ; J Abdelali 3 ; F Larbret 4 ;
W Vainchenker 2 ; N Debili 2
Hématopoïèse et Cellules Souches Normales et
Pathologiques, Inserm U790 igr, Villejuif; 2 Hématopièse et
Cellules Souches Normales et Pathologiques, Inserm U790 igr,
Villejuif; 3 Ifr54, Institut Gustave Roussy, Villejuif; 4 Ifr54, Inserm
U790 igr, Villejuif
1
Contexte
Les plaquettes, cellules sanguines anucléées, naissent par fragmentation des mégacaryocytes (MK). La différenciation terminale des MK présente un aspect très spécifique : la polyploidisation des MK immatures par un mécanisme appelé endomitose.
Ce système d’endomitose permet au MK de doubler à chaque
cycle leur quantité d’ADN sans division nucléaire ni cytoplasmique, devenant ainsi polyploïdes. Les études initiales ont montré
que l’endomitose des MK se passe comme une mitose normale
jusqu’à l’anaphase A. Cependant, un défaut d’élongation du
fuseau cellulaire est associé à une absence de l’anaphase B. A
cause de la rareté des endomitoses et de la limite des techniques, il était très difficile de déterminer précisément comment se
déroule les étapes terminales des endomitoses. Notre objectif a
été de comprendre précisément le processus.
Matériels et méthodes
La surexpression de H2b-GFP dans les MKs obtenus in vitro à
partir de cellules CD34 de la moelle a été réalisé soit par électroporation ou infection lentivirales. Les études de localisation
des protéines ont été réalisées par des expériences d’immunofluorescence. Les endomitoses ont été observés en temps réel
par vidéomicroscopie.
Résultats
Dans un premier temps, nous avons étudié l’expression des protéines passagères du chromosome et des protéines associées au
fuseau central qui sont présentes dans la midzone en fin d’anaphase dans une mitose normale (Survivine, PRC1, Aurora B)
par la technique d’immunofluorescence. Nos résultats montrent
que ces protéines sont distribuées normalement au cours des
endomitoses suggérant l’existence d’une midzone obligatoire
pour une cytocinèse. Afin de suivre précisément la dynamique
du noyau au cours des endomitoses, nous avons surexprimé
dans les MK obtenu in vitro à partir des cellules CD34 l’histone
9
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Hématopoïèse
été décrit dans certaines cellules malignes. Ce phénomène a
été observé pour des cellules 4N, 8N et voire plus.
Conclusion
Au total, les endomitoses ne correspondent pas à un défaut
d’un point de contrôle du cycle cellulaire mais à un défaut de
la cytocinèse et du fuseau mitotique suggérant un défaut majeur
du cytosquelette.
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H2b-GFP et par la technique de vidéomicroscopie confocale
en temps réel nous avons suivi les MK. Les résultats obtenus
montrent pour la première fois que les endomitoses se déroulent
en fait comme des mitoses normales jusqu’à la fin de la mitose
avec des cellules filles quasiment séparées qui brutalement se
remettent ensemble par un processus de rétro-cytocinèse où les
deux cellules et les noyaux fusionnent. Un processus proche a
10
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