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Biologie cellulaire - Cours 1 - corporation des carabins nicois

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Biologiecellulaire
Année2016/2017
Présentationdelamatière:
• PrGilson
• 15ainedecoursàlafac
• 15QCMaupartielenUE2soitbeaucoupde
points
Sommaire
I) Introductionàla
biologiecellulaire
II)Méthoded’étudedela
cellule
A)Théoriecellulaire
B)Organisationdelacellule
C)Cyclecellulaire
D)Cellulessoucheset
homéostasie
A)Intro
B)Microscopieoptique
C)Fluorescence
D)Microscopieélectronique
E)AFM
I)Introductionàlabiologiecellulaire
A)Intro
qEssordel’observation
2postulatsfondamentaux:
1°Lacelluleestl’unitéfonctionnelleet
structuraledebasedesêtresvivants
2°Toutecelluleprovientd’unecellule
préexistante
B)Théoriecellulaire
• Compositioncellulevivante:
• 70%H2Olereste=ions,ADN,ARN,sucres
• 10^14cellules10^15bactériesdanslecorps
• Cettecompositionamèneaunedistinction:
• Vivant/Inerte
• Sélectivité
• Catalyse
• Interactionsmoléculaire
C)Organisationcellulaire
Procaryote
Pasdenoyau
ADNcirculaire
Traductionco-transcriptionnelle
Eucaryote
Noyaudélimitéparunedouble
membrane
Traductionettranscription
découplées
Organisationd’unecelluleeucaryote:
Noyau :
- lieudeconservationdel’ADN
- entouréd’unedoublemembrane
Lecytosol:
-liquidedanslequelbaignentlesorganites
-siègedelaplupartdesréactions
-Pasunorganite
Membraneplasmique
• Bicouchedephospholipide
• Deuxfeuillets:hydrophileal’ext et
hydrophobeàl’intérieurdeceux-ci
Enveloppenucléaire
• Doublebicouchelipidique(différentdela
MBplasmique)
• EncontinuitéavecleRE
Systèmeendo-membranaire
• Ensembledecavitésdélimitésparune
membrane
• Communiqueentresellepardesvésicules
Leréticulumendoplasmique
L’appareildegolgi
• Unseulparcellule
• Responsabledelaformationdevésiculeset
lesenvoiaudifférentsendroitdelacellule
Endosome
• Capturelesmoléculesdel’extérieurdela
cellule
• Rôlenourricier
Lysosome
• Lieudedégradationdemolécules
complexes
Organitesisolés
• Peroxysome:
Lieudedétoxificationdelacellule
Présencedenombreuseenzymes
hydrolytiques(peroxydase)
Mitochondrie
-Plusieursparcellule
-3groupescellulaire,unancêtrecommunLUCA
-Principalelieudecréationd’énergie
Évolutioncellulaire
Eubactéries(=bactéries=procaryote)
Archaebactéries(serapprochedeseucaryote)
sontdesbactériesextrémophiles
Eucaryotes
Théoriedel’endosymbionte
Evolutionmoléculaire
c)Cyclecellulaire
•
•
•
•
PhaseG1
PhaseS
PhaseG2
PhaseM
Programmationcellulaire
•
•
•
•
•
•
Division
Différenciation
Motilité
Quiescence
Sénescence
Mort:apoptose ounécrose
D)Cellulessouchesethoméostasie
• Cellulessouches:
-nondifférenciée
-capabledesediviser
-auto-renouvellement
-sedifférencieàla
demande
Typesdecellulessouches:
• Celluletotipotente
• Cellule
pluripotente
• Cellule
multipotente
• Celluleunipotente
Cellulessouchesembryonnaires
• Pluripotente
• Présenteaustade
deblastocyste
• Pasderejet
• Problèmeéthique
etphysique
(tumeur)
Cellulessouchepluripotenteinduite
• PrYamanaka
• Pasderejet
• Pasbesoind’embryon!!
Homéostasie
• Capacitéd’unorganismevivantàrevenirà
unétatoriginelaprèsuneperturbation
• Ex:glycémieounombredecellules
• Catastrophiqueencasdedéfaillance
II)Méthoded’étudedelacellule
A)Introduction
• 3typesdemicro:
• Optique,électroniqueetatomique
• 3résolutionsdifférentes
• Résolution:capacitédedistinguerdeux
objetscôteàcôte.
B)Microscopieoptique
•
•
•
•
•
Microscopieoptiqueconventionnelle
Microscopieàcontrastedephase
Microscopieàfluoresence
Microscopieconfocale
Résolution:0.2mmà200nm
Microscopieoptiqueconventionnelle
• Observationlumièredirecte
• Œilobservel’imageagrandie
• Nécessitédefixerl’échantillon(souventcar
échantillonmou)
Microscopieàcontrastedephase
• Utilisationdespropriétéderéfractionde
l’échantillon
• Amplificationdudéphasage
• Pasdefixation,possibilitédetimelapse
Microscopieàfluorescence
• Observationindirecteviadesfluorochromes
• Excitationdesmoléculesgrâceàdes
longueursd’ondesspécifiques
Microscopieconfocale
• Techniquedemicroscopieàfluorescence
• Permetuneétudetridimensionnelle
• Sélectionduplandefocalisation,diminution
dubruit,permetimage3D
C)Fluorescence
• Principe :
- Moléculefluorescentecapabled’absorberde
l’énergie(lumièred’excitation)etdela
restituerrapidement(lumièred’émission)
- Permetd’observerdesmoléculesspécifiques
Différentsfluorochromes
• GFP:absorbedanslebleu,émetdanslevert
• Propriétéfluorescenteintrinsèque
• S’exprimedansn’importequellecellule
• Fluorescéine:absorbedanslebleu,émet
danslevert
• Rhodamine:absorbedanslevert,émet
danslerouge
Commentintroduiredesmolécules
fluorescentesdanslacellule?
• 1)lamicroinjection :
-Injectionavecunemicropipettedu
fluorochrome
-Injectioncelluleparcellule,peuutilisé
• 2)électroporation :
- Chocélectriquequicréedemicropores
transitoires
- -traitementdeplusieurscellules
- Peuphysiologique,peuutilisé
• 3)vectorisationparvésicule
- Onmetlescellulesenprésencede
fluorochromes
- parfusionlesvésiculesfranchissentlaMB
plasmique
- Méthodelaplusdouceetphysiologiquequi
soit!
RAPPEL
• ADN(doublebrin)
• Transcriptiondel’ADNenARNgrâceàl’ARN
polymérase
• Traductiondel’ARNenplusieursAcides
Aminésquiformentlaprotéine
correspondante
• Protéinerejointsapositioncellulaireetjoue
sonrôle
• 4)Expressiond’ungènecodantpourla
protéined’intérêt
-connaissancedugènecodantpourlaprotéine
d’intérêt
-greffedelaséquencedelaGFP(parexemple);
obtentiond’ungènehybrideGFP-prot
-transfection decegènedanslacellule
-transcription,traductionetexpressiondenotre
prot hybride
DémontrervsSuggérer
• Démontrer=aucuneautrepossibilités
possibles(rareenmilieuexpérimental
#biocell)
• Suggérer=toutlaissesupposerqueceque
l’onaffirmeestvraimaispasà100%
Exemple :
Ici,jedémontrequelaprotéinedefusion
GFP-prot estmembranaire
Jesuggèrequelavéritableprotéineest
membranaire(peutêtrequelafusion
traductionnelleamodifiéses
caractéristiques…)
Applicationàlafluorescence
•
•
•
•
•
•
FRET
FRAT
FLIP
FISH
Immunofluorescenceindirecte
Fluorescenceinduite
FRET(FluorescenceResonance
Energy Transfert)
• Permetl’étudedesinteractions
moléculairesviauntransfertd’énergienon
radiatif
• Principe :ongreffedesfluorochromes aux
moléculesquel’onveutétudier.Ilfautque:
- lespectred’émissiondudonneurrecouvre
lespectred’absorptiondureceveur
-lesmoléculessoientespacésdemoinsde10
nm
FRETintermoléculaire
FRETintramoléculaire
• Exempledelasondecaméléon:
-Permetdemesurerletauxdecalcium
-Modificationdutauxdecalcium=chgmt de
conformationmoléculaire
-Deuxextrémitésdelasondecalciquese
rapprochentquandletauxdecalcium
augmente
Principe:
• Ongreffedeuxfluorochromes àchaque
extrémités
• Sicalciumaugmente,transfertdelumière
sinonpasdetransfert
• Fluorescenceseraproportionnelleautaux
decalcium
FRAP
• Techniquebaséesurlephotoblanchiment
delacellule
• Onirradieunpointprécisdelacellule
(l’irradiationdelafluorescenceest
irréversible)
• Puisonobserveleretourdelafluorescence
• Permetl’observationdumouvementdes
moléculesfluorescente
FLIP
• Onirradieunpointdelacelluleencontinu
• Onobserveladisparitiondelafluorescence
Fluorescenceinduite
• Rappel:uncolorantdevientfluorescent
lorsqu’ilsefixeàsamoléculed’intérêt.
• Deuxcolorants:
-Hoechstetdapi :sefixespécifiquementsur
lesbasesAetT
-Lesintercalants :sefixenonspécifiquement
Immunofluorescenceindirecte
• Définition:
-Protéinejouelerôled’AG
-Utilisationd’ACmonoclonaux
-Anticorpsprimaires:reconnaissentlaprot
-Anticorpssecondaires:reconnaissent
l’anticorpsprimaire,reconnaîtl’anticorps
primaire
Explication
Attention
• L’anticorpsprimaireetsecondairedoivent
apparteniràdeuxespècesanimales
différentes
• Pourétudierconjointementdeuxprot
différentesonutilisedeuxfluorochromes
différents
QCM
Vousvoulezétudieruneprot Xetuneprot Y.OnutilisedesAc de
chevauxcontreXetdesAc degazellecontreY.QuelsAc secondaires
permettentl’étudeconjointedeXetY?
A) DesAc dechimpanzéantiimmunoglobulinedechevauxcouplésàla
GFPetdesAc dePandaantiimmunoglobulinedegazellecouplésàla
fluorescéine.
B) DesAc dechimpanzéantiimmunoglobulinedechimpanzécouplésà
laGFPetdesAc dePandaantiimmunoglobulinedegazellecouplésà
lafluorescéine
C) DesAc dechimpanzéantiimmunoglobulinedechevauxcouplésàla
GFPetdesAc dePandaantiimmunoglobulinedegazellecouplésàla
rhodamine
D) DesAc dethug(drôledezèbred’ailleurs)antiimmunoglobulinede
chevauxcouplésàlaGFPetdesAc debeurette antiimmunoglobuline
degazellecouplésàlafluorescéine
Bonneréponse:C)
•
Immunofluorescencedirecte
• Utilisationd’Ac primairesdirectement
couplésàunfluorochrome contrelaprot
d’intérêt
• Défaut:moinsdeprécisionpar
augmentationdubruitdefond
FISH(Filet-O)
• Techniqued’hybridationinsitud’acides
nucléique(DNA)
• Permetd’étudierlalocalisationd’ungène
• Permetuneétudechromosomique
• Permetdefairedejoliescaryotypescoloré
(avantageprincipalévidemment)
Principe :
• Dénaturationdel’ADN
• Ajoutdelasondefluorescente
• Hybridationspécifique
• Révélation
FISHbis
• Pluslasondeestlongueplusellesera
spécifiquedugène
• Possibilitéd’étudierdesARNmaispasde
dénaturationvuquelesARNsontsimple
brin
• Fishnepermetpasd’étudesvivantescar
dénaturationdel’ADN
D)Microscopieélectronique
• Résolution:200à0.2nm(meilleurque
l’optique)
• Permetl’observationdesorganellesetdes
molécules
• Utilisationd’e- etplusdephotons
Préparationd’unéchantillonenME
• Fixation
• Déshydratation(perted’informationdela
physiologiedelacellule)
• Miseenrésinedel’échantillon
• Agentdecontraste
2typesdeME
• Microscopieélectroniqueàtransmission
• Microscopieélectroniqueàbalayage
MEàtransmission
• Utilisationd’unfaisceaud’électronsqui
traversel’échantillon
• Onregardecequipasse
• Plusunestructureestdenseauxélectrons
pluselleapparaitrafoncé
• Permetdebienvoirlescontoursdela
celluleetdesorganites
PlusieurstechniquedeMET
• 1)marquageàl’or
Greffed’unebilled’oràunACquiestdirigé
contrelaprot
Amplificationdusignal(orestdenseaux
électrons)
• 2)Ombrage
-étudedelasurfacedel’échantillon
-systèmesousvide
-répliqueenmétaldelasurfacedel’échantillon
-Dissolutiondel’échantillonestobservationdela
réplique
-Visualisationindirecte
• 3)Cryomicroscopie
→Limiteladénaturation
Principe:
-congélation
-fracturationdel’échantillondansleszones
demoindrerésistance(MB)
-décapageetvaporisationdeplatinepuis
observationdelaréplique
Microscopieàbalayage
• Onregardecequiestréfléchi
• Electronssontréfléchitparl’échantillon
• Recueild’électronssecondaires
• Moinsbonnerésolutionqu’enMET(10nm)
E)Microscopieàforceatomique
Imagedirectedel’échantillon
Mesuredesvolume
Echantillonsnonfixés
Balayagedel’échantillonavecunepointe
trèsfine
• Utilisableenphaseliquide
• RésolutionsupérieureouégalealaME
•
•
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